Micromodelação do Cromossomo Y

Genética da Infertilidade Masculina

Cerca de 15 a 20% dos casais têm algum tipo de dificuldade para engravidar, necessitando de auxílio através de técnicas de Reprodução Assistida (RA) como a Inseminação Intra-Uterina (IIU), a Fertilização in vitro (FIV) ou a injeção intra-citoplasmática de espermatozóides (ICSI). Diferente do que se acreditava antigamente, em metade desses casais o fator de infertilidade é masculino.

Nesses homens, diferentes tipos de defeitos na espermatogênese (produção de espermatozóides) e na função testicular podem ser investigados por inúmeros testes andrológicos que, no entanto, falham em definir a etiologia em cerca de 50% dos casos. Um bom exame físico, realizado por médico especialista (urologista ou andrologista), associado a alguns testes laboratoriais são fundamentais para que sejam identificadas as causas da infertilidade masculina.

Técnicas de biologia molecular estão começando a elucidar alguns dos mecanismos envolvidos nas diversas etapas da espermatogênese e espermiogênese (maturação dos espermatozóides dentro dos testículos). Uma das causas encontradas é devida à presença de microdeleções no braço longo do cromossomo Y (Yq).



O cromossomo Y

Há muito tempo é sabido que a determinação sexual nos mamíferos é realizada pelos cromossomos. Enquanto as fêmeas possuem 2 cromossomos X, os homens possuem um cromossomo X e um cromossomo Y.

Fatores presentes no cromossomo Y são necessários para a diferenciação das gônadas primitivas do embrião no sentido de se organizarem em testículo. Na ausência desses fatores presentes no cromossomo Y, o indivíduos formará ovários. Assim, de forma geral, quem possui cromossomo Y é homem, e quem não o tem, é mulher.

Quando se faz um exame chamado cariótipo, capaz de visualizar os cromossomos ao microscópio (figura 1), verificamos que as mulheres possuem 23 pares de cromossomos (figura 2a), sendo que um dos pares é constituído por dois cromossomo X (46,XX); nos homens, que também têm 23 pares de cromossomos, o par de cromossomos sexuais é constituído por um X e um cromossomo Y (figura 2b).



Figura 1: imagem obtida dos cromossomos humanos em microscópio. Essa imagam é analisada para identificação dos cromossomos e montada como na figura 2.



Figura 2: a) montagem de cariótipo normal de mulher indicando a presença de 23 pares de cromossomos com o par de cromossomos sexuais constituído por 2 cromossomos X; b) montagem de cariótipo normal de homem 46,XY.



Figura 3: esquema representando o cromossomo Y.
à direita o cromossomo Y corando para o padrão
de bandas G no cariótipo; à esquerda as principais
regiões do cromossomo Y definidas pela biologia
molecular. As linhas vermelha, azul e verde entre os esquemas da direita e da esquerda fazem a
correspondência da localização de AZFa, AZFb e AZFc respectivamente.

Esse fator, que está presente no cromossomo Y, e que quando está presente promove a formação de testículos, é denominado SRY . Todo homem possui SRY. Assim, qualquer exame molecular que vise investigar o cromossomo Y de um homem, deverá incluir a pesquisa de SRY.

Se por um lado, SRY é fundamental para que existam os testículos, SRY sozinho não basta para que esses testículos produzam os espermatozóides, necessários para a fertilidade masculina. Para a produção adequada dos espermatozóides, outros fatores fundamentais devem estar presentes, os chamados fatores de azoospermia , que também estão localizados no cromossomo Y, bem distantes de SRY, na região de nome AZF (azoospermic factor [figura 3]).


A região AZF está subdividida em 3 sub regiões, AZFa, AZFb e AZFc (figura 3), cada uma delas contendo informações genéticas específicas. A ausência total ou parcial dessas informações compromete a espermatogênese em maior ou menor grau. No cromossomo Y, a ausência dessas informações se dá por perda de pedaços de DNA, isto é, por deleção do DNA.

Quando alguma dessas regiões está ausente, dizemos que o homem é portador de uma microdeleção em seu cromossomo Y. Homens com microdeleção, quando fazem o cariótipo, geralmente o resultado é normal, 46,XY, pois essas perdas de DNA não podem ser vistas ao microscópio. Apenas alguns casos mais raros, em que a perda de DNA do Y é muito grande, podem ser vistos ao microscópio. Nesses casos, o pedaço do cromossomo Y que resta é bastante pequeno, sequer sendo possível afirmar que se trate de um cromossomo Y. Nesses casos o cromossomo alterado é denominado marcador.

 


Figura 4: montagem do cariótipo de homem azoospérmico, indicando uma deleção de grandes porções do cromossomo Y (indicado na seta), de tal forma que o que restou não pode ser identificado como sendo um cromossomo Y. Assim, o resultado do cariótipo é fornecido como 46,X,+mar, isto é, existem 46 cromossomos, um deles é um X e o outro é um marcador que não pode ser identificado.



Como são estudadas as microdeleções?

Existe um teste molecular que é realizado através de uma técnica chamada de PCR (reação em cadeia da polimerase). A técnica consiste em tirar sangue do paciente (veja as indicações para o exame), extrair o DNA das células desse sangue, e colocar esse DNA em vários tubos plásticos muito pequenos, contendo sondas e enzimas. Essas sondas são construídas sob medida, de modo que, quando misturadas ao DNA de homens, elas são capazes de identificar especificamente as regiões do cromossomo Y que se deseja estudar. As sondas devem ser escolhidas de forma a identificar ou não a presença das 3 regiões AZF no cromossomo Y.

Quando a sonda encontra a região desejada, ela copia essa região cerca de 1 bilhão de vezes, auxiliada pela enzima polimerase, em uma reação realizada em uma máquina especial (figura 5 ). Depois de terminadas as reações, o conteúdo dos diferentes tubos plásticos contendo as cópias desejadas das diferentes regiões AZF, são colocado em uma gelatina e submetidos a uma corrente elétrica (eletroforese) por cerca de 1 hora. O gel é retirado da cuba (figura 6), é corado com corante específico para DNA e visualizado sob iluminação ultra-violeta. O cromossomo Y que contém a região copiada mostra uma banda branca nítida, na altura do gel esperada para a região. Homens com microdeleção não possuem a banda corada (figura 7).

Figura 5: termocicladora, máquina em que é realizada a reação de PCR (reação em cadeia da polimerase).




Caixa de texto: Figura 6: cuba de eletroforese utilizada para correr as amostras amplificadas por PCR em um campo elétrico.


Quais as sondas utilizadas?

As sondas utilizadas devem cobrir de forma satisfatória todas as 3 regiões do cromossomo Y, isto é, devem ser usadsa sondas para investigar AZFa, AZFb e AZFc. Devem também incluir a pesquisa de SRY.

Caixa de texto: Figura 7: resultado da coloração do gel com amostras de PCR de pacientes numerados de 64 a 83, utilizando sonda específica para a região sy143 do cromossomo Y, localizada em AZFb. Notar que os pacientes 66, 67 e 76 não possuem a banda, o que representa a ausência dessa região em seus respectivos cromossomos Y.
A escolha das sondas deve estar firmemente baseada e atualizada com os dados da literatura mundial.

Indicações para a pesquisa de microdeleções.

Como já foi dito, a microdeleção é resultado da perda de pedaços do DNA do cromossomo Y, presentes nas regiões AZF, importantes para a produção e maturação dos espermatozóides. Todos os homens com redução acentuada do número de espermatozóides no sêmen devem realizar a pesquisa.

O mais aconselhável é que a pesquisa seja solicitada quando o resultado de pelo menos dois espermogramas indicar uma concentração de menos de 5 milhões de espermatozóides por mililitro de sêmen ejaculado. Microdeleções ao identificadas em cerca de 15 a 25% dos homens azoospérmicos e em aproximadamente 10% dos homens com produção gravemente comprometida de espermatozóides (menos de 5 milhões/ml)

Microdeleções em homens com mais de 5 milhões de eptz/ml são encontradas apenas em raros casos, e devem ser solicitadas apenas em casos específicos, bem como outras alterações no espermograma.

Todos os homens portadores de microdeleções no cromossomo Y devem passar por um aconselhamento genético, que visa explicar as causas biológicas das microdeleções e alternativas de seus portadores quanto a constituição de suas famílias através das técnicas de reprodução assistida.

Sêmen

Definição

Freqüência de microdeleções

Azoospermia

Ausência de espermatozóides no sêmen ejaculado

15-25%

Oligozoospermia muito grave

Menos de 1 milhão de espermatozóides/ml de sêmen ejaculado

8-10%

Oligozoospermia grave

Entre 1 e 5 milhões de espermatozóides/ml de sêmen ejaculado

3-5%

Caixa de texto: Tabela 1: Resultado do espermograma, número de espermatozóides encontrados por milimitro de sêmen ejaculado e freqüência de microdeleções encontradas.

Dra. Patrícia de Campos Pieri
Doutora em Genética pela USP
pcpieri@biogenecs.com.br


Glossário

Espermatogênese: processo de divisão celular que dá origem aos espermatozóides. É realizada nos testículos e leva entre 65 e 72 dias para se completar.

Gônada: cada um dos órgãos produtores dos gametas. As gônadas femininas são os ovários, que produzem os oócitos, e as gônadas masculinas são os testículos, produtores dos espermatozóides.

SRY: gene presente no cromossomo Y e responsável pela formação dos testículos.

 
 
 
 
 
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